谷-胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒

測(cè)定意義

谷-胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的

一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷-胱甘肽（GSH）對(duì)過(guò)氧

化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。GSH-PX 的活性中

心是硒半胱-氨酸，硒是 GSH-PX 的必需部分，每克分子酶含 4 克原子硒。測(cè)定 GSH-PX

的活力可以作為衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。

測(cè)定原理

谷-胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）可以促進(jìn)過(guò)氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘

肽（GSH）反應(yīng)生成 H2O 及氧化型谷-胱甘肽（GSSG），谷-胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力

可用其酶促反應(yīng)的速度來(lái)表示，測(cè)定此酶促反應(yīng)中還原型谷-胱甘肽的消耗，則可求

出酶的活力。

GSH-PX 的活力以催化 GSH 的反應(yīng)速度來(lái)表示，由于這二個(gè)底物在沒(méi)有酶的條

件下，也能進(jìn)行氧化還原反應(yīng)（稱(chēng)非酶促反應(yīng)），所以最后計(jì)算此酶活力時(shí)必須扣除

非酶促反應(yīng)所引起的 GSH 減少的部分。

GSH 量的測(cè)定：GSH 和二硫代*甲酸作用生成 5-硫代*甲酸陰離

子呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色，在 412nm 處測(cè)其吸光度即可計(jì)算出 GSH 的量。

試劑盒有效期和保存條件

本試劑盒保存期：6 個(gè)月；貯存溫度：4℃。

注 意

注 1：空白管、標(biāo)準(zhǔn)管一般只需做 1—2 只。

注 2：取樣量及取樣濃度因樣品種類(lèi)不同，其 GSH－PX 活力不一。

根據(jù)酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關(guān)系 ，各種測(cè)定樣品取樣量及取樣濃度

不一樣，在每測(cè)定一種新的樣品前最好選擇一個(gè)取樣量及取樣濃度。

取樣濃度的摸索：

測(cè)試前先預(yù)試以確定取樣濃度：當(dāng)您第一次使用本試劑盒測(cè)試某一種新

的樣品時(shí)最好先做三只不同濃度的測(cè)試管。例如：

測(cè)全血：則分別取用蒸餾水 1︰24、1︰49、1︰99 稀釋的溶血液 200μL 進(jìn)行

預(yù)試；

測(cè)組織勻漿：則分別取 10%、5%、1%等的勻漿 200μL 進(jìn)行預(yù)試（不同樣本

稀釋濃度不同）；

測(cè)血清：則分別取未稀釋的血清及用生理鹽水 1︰1、1︰4、1︰9、1︰19 稀

釋的血清 100μL 進(jìn)行預(yù)試，

結(jié)果應(yīng)該在 15%～

55%之間，然后取百分抑制率在 45%或 50%左右的一管作為取樣濃度，因?yàn)?/span>

酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關(guān)系，若百分抑制率大于 60%時(shí)（曲線的平

坦部分），則需將樣品濃度稀釋后再測(cè)試。若百分抑制率小于 20%時(shí)，則需將樣

品濃度加大后測(cè)試。（需要注意的是組織勻漿或其他類(lèi)似樣本有時(shí)本身濁度或顏

色有干擾時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)不必通過(guò)抑制率計(jì)算，這時(shí)可以用對(duì)照 OD 值-測(cè)定 OD 值在

0.2 左右時(shí)來(lái)判定）

這樣做對(duì)科研結(jié)果分析及檢驗(yàn)有很大幫助；若百分抑制率大于 60％或小于 10％，

各個(gè)測(cè)定組的結(jié)果在檢驗(yàn)中有可能無(wú)顯著性差異。

全血中 GSH-PX 活力的測(cè)定

一、樣本的前處理：溶血液的配制

①、取肝素抗凝全血 20μL，以蒸餾水稀釋至 1ml，配成 1∶49 的溶血液；鼠血 10μL

加蒸餾水至 1ml，配成 1∶99 的溶血液。

②、充分混勻，放置 5 分鐘直至使玻璃管中的溶血液對(duì)光呈透明狀，方可進(jìn)行

檢測(cè)。

③、已配好的溶血液中 GSH-PX 活力只能保持 45～60 分鐘，天冷時(shí)可延遲至 120

分鐘。如果當(dāng)天來(lái)不及測(cè)定則以抗凝全血冰箱（ 4℃～8℃）保存，2～3 天內(nèi)

酶活力變化不大。

【注 1】請(qǐng)?jiān)谡綄?shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，詳見(jiàn)溶血液的取樣濃度及取樣量的摸

索舉例；

【注 2】測(cè)溶血液中 GSH－PX 含量要注意樣品測(cè)試前紅細(xì)胞一定要充分溶血。（以

對(duì)光觀察透亮為標(biāo)準(zhǔn)，若不透亮可以?xún)鋈芤淮?，但有部分大鼠及豬的紅細(xì)胞

是不可放置 0℃以下，否則不易溶血，例如糖尿病大鼠和部分正常大鼠的紅

細(xì)胞凍后很難溶血。在做正式試驗(yàn)前最好先取 1～2 只樣本做預(yù)試。）

組織、線粒體和細(xì)胞膜中 GSH－PX 活力的測(cè)定

一、樣本的前處理：

1、10%組織勻漿的制備：

a.、取組織塊（0.2～1 克）用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)

重，放入 5～10ml 的小燒杯內(nèi)。

b、用量筒量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（PH7.4，0.01mol/L 蔗糖，0.01mol/L Tris-HCl，

0.0001mol/LEDTA2Na 溶液）或生理鹽水。勻漿介質(zhì)或 0.86%生理鹽水的量

應(yīng)該是組織重量的 9 倍。

c、將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩下的 1/3 勻漿介質(zhì)或 0.86%生理鹽

水用來(lái)沖洗殘余在小燒杯中的碎組織一起倒入玻璃勻漿管中進(jìn)行勻漿，左

手持勻漿管將下端插入盛有冰水的器皿中，右手將桿垂直插入套管中上下

轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 分鐘），充分磨碎，使組織勻漿化?；蛘哂媒M織搗碎

機(jī) 10000～15000r/min 研磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿器制

成 10%組織勻漿（勻漿時(shí)間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 3～4 次，溫度 0～

4℃），心肌組織等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。

d、將制備好的 10%勻漿用普通離心機(jī)或低溫離心機(jī) 3000r/min 左右離心 10～

15 分鐘。取上清待測(cè)。【注】根據(jù)預(yù)試結(jié)果取濃度進(jìn)行測(cè)定

2、線粒體的制備：

取 10%的組織勻漿 5～10ml，以 1000～2000r/min 離心 10 分鐘（用普通離

心機(jī)或低溫低速離心機(jī)），取上清液以 8000～10000r/min（低溫高速離心機(jī)）離

心 15 分鐘，沉淀物為線粒體。

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